花色素对白血病细胞株K562 细胞增殖

  K562 细胞是一种分化极差、恶性程度较高的人红白血病细胞株。研究证明,其在体外可被多种诱导剂诱导,可分别向红系、粒系、单核巨嗜细胞系及巨核细胞系分化。花色素是一类分布十分广泛的植物色素,具有类黄酮的典型结构。有研究表明,花色素对人乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等肿瘤细胞具有生长抑制作用。其作用机制与抗氧化作用、抑制肿瘤细胞增殖、诱导癌细胞凋亡和分化等有关,且对机体无明显不良反应。本研究通过体外培养K562 细胞,观察花色素对K562 细胞的形态变化,探讨花色素对K562 细胞关于增殖方面的作用,为临床上白血病的治疗提供新思路。
  1 材料与方法
  1. 1 材料
  花色素( 购自上海惠诚责任有限公司) ; RPMI-1640 培养基( 美国GIBCO 公司) ; 新生牛血清( 杭州四季青生物工程材料有限公司) ; MTT 试剂盒( 武汉博士生物工程有限公司) ; CO2细胞培养恒温箱购于美国Forma Scientific 公司; 倒置相差显微镜( Olympus公司) ; 96 孔培养板( 美国Falcon 公司) ; 流式细胞仪( 美国Becton-Dickinson 公司) ; 自动酶标仪( BIORAD公司550 型) 。K562 细胞为吉林医药学院检验学院细胞室冻存细胞,接种K562 细胞于含10%新生牛血清的RPMI-1640 完全培养基,37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养,取对数生长期细胞用于试验。
  1. 2 细胞培养
  常规传代培养K562 细胞至对数生长期,将对数生长期细胞分成5 组,以每孔1 × 105 接种于96 孔板中,24 h 后分别加入花色素,使终浓度分别为25、50、100、200 mg /L,并设置对照组,培养24 h 后于倒置显微镜下观察细胞状态并拍照。
  1. 3 瑞氏染色观察
  常规传代培养K562 细胞至对数生长期,将对数生长期细胞分成5 组,24 h 后分别加入花色素使终度分别为25、50、100、200 mg /L,并设置对照组,培养24 h后收集各组细胞,离心800 r /min,5 min,弃上清,将细胞沉淀涂布于载玻片上,甲醇固定10 min 后取出,PBS 冲洗,自然晾干,滴加瑞氏染液1 min 后再加入等量的PBS,混匀,静置5 min 后,细流水洗,吸干,镜检观察并拍照。
  1. 4 MTT 法检测
  取对数生长期K562 细胞制成细胞悬液,浓度为1 × 105 /mL,接种于96 孔板内,每孔100 μL,加入不同浓度的花色素使终浓度分别为25、50、100、200 mg /L,每一浓度均设4 个复孔,并设对照及凋零孔,分别在加药24、48、72 h 后加入MTT 溶液10 μL,37 ℃ 继续培养4 h,终止培养,离心1 000 r /min,5 min,弃去孔内培养液,每孔加入100 μL Formazan溶解液,振荡10 min,用酶联免疫检测仪在570 nm 波长下测各孔吸光度,按下列公式计算抑制率。
  IR% = ( 1-试验组平均A 值/对照组平均A 值) × 100%
  1. 5 统计学处理
  数据以x ± s 表示,单因素方差分析,组间均数比较采用t 检验,率比较采用χ2 检验。
  2 结果
  2. 1 花色素对K562 生长的影响
  细胞加药处理后,镜下观察发现花色素对K562细胞的生长有抑制作用,与对照组相比,加药组细胞分散,体积缩小,胞体减小,死亡细胞增多且明显。经数据分析发现,不同浓度的花色素对K562细胞的生长均有抑制作用,呈浓度和时间依赖性。
  2. 2 瑞氏染色
  收集各组细胞涂片,瑞氏染色光学显微镜观察细胞形态,对照组细胞形态明显改变,胞体大小不一,不规则,胞质浓染,核浆比例减小,趋于分化成熟,可见中晚幼细胞。
  2. 3 花色素对K562 细胞的生长抑制率作用MTT 结果证实,花色素能够明显抑制K562 细胞生长,且有浓度依赖关系。随着浓度从25 μg /mL 增加到200 μg /mL,对细胞生长抑制率也逐渐增加。
  3 结论
  人红白血病K562 细胞是一株恶性程度较高的人红白血病体外细胞系,但在体外可被多种诱导剂诱导发生凋亡、分化和增殖抑制。因此K562 细胞是临床和基础领域中筛选新的抗肿瘤药物和研究调控胚胎型和胎儿型珠蛋白基因表达的分子机制的常用模型。有研究表明K562 细胞能向红系发展而且K562 细胞的血红蛋白合成是和其细胞不同程度的增殖诱导相联系的,而这种增殖诱导则取决于诱导剂的性质。
  用 25 ~ 200 μg /mL 的花色素处理人红白血病K562 细胞后,通过镜下观察发现,细胞形态发生明显变化。绘制的生长曲线也显示随着加入物浓度及时间的增长,细胞数逐渐减少。应用MTT 比色法等检测发现花色素在体外可抑制K562 细胞生长,并呈时间-剂量依赖性。
  据国外统计,白血病约占肿瘤总发病率的3% 左右,是儿童和青年中最常见的一种恶性肿瘤。白血病的发病率在世界各国中,欧洲和北美发病率最高死亡率为3. 2 ~ 7. 4 /10 万人口。亚洲和南美洲发病率较低,死亡率为2. 8 ~ 4. 5 /10 万人口。因此,开发研究出一种天然高效的抗肿瘤药物是极具意义的。花色素具有一定的增殖抑制效应,同时本研究也表明其对K562 细胞可能具有较强的抑制作用,提示该药具备较好的应用前景。